ле иммунизации свинкам двух групп
внутрисердечно или внутривенно вводят ту же или удвоенную дозу антигена,
использованного для сенсибилизации. Реакция у животных наступает через 1 - 2
мин. Наблюдают за животными в течение 30 мин.

Оценка реакции производится по четырехплюсовой системе:

А (+) - кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти,
падение температуры (не менее чем на 1°);

Б (++) - четко выраженные частые почесывания, единичные чихания,
падение температуры;

В (+++) - спастический кашель, боковое положение животного,
отделение кала и мочи;

Г (++++)- спазм дыхательных путей, конвульсивные движения,
судороги. Животные погибают;

Д - реакция отсутствует.

Полученные результаты в контрольной группе сравнивают с
результатами в опытной группе.

В качестве положительного контроля используют животных,
сенсибилизированных нормальной гетерологической сывороткой и получивших разрешающую
дозу в те же сроки. Одновременно разрешающую дозу испытуемой БАД "per
os" вводят животным, которые предварительно получили соответствующий объем
0,9%-ного хлорида натрия - отрицательный контроль.

Индекс синдрома в группе вычисляют по формуле Вейгла (И):

 

               (А x 1) + (Б x 2) + (В x 3) + (Г x 4)

           И = -------------------------------------,

                        А + Б + В + Г + Д

 

где А, Б, В, Г, Д - число животных с данной выраженностью
синдрома.

Изучаемые БАД не должны вызывать развития смертельного шока.

 

Изучение действия БАД на показатели

окислительно - антиокислительной системы

 

Общие положения

 

К основным внутриклеточным химическим повреждающим агентам
следует, в первую очередь, отнести свободные радикалы, образование которых
приводит к нарушению функционирования клеточных структур, включая биологические
мембраны. Наибольшее значение для патологии имеют свободные радикалы кислорода,
а также пероксид водорода. Все эти так называемые активные формы кислорода
образуются в большом количестве клетками - фагоцитами, а также могут
образовываться в митохондриях и эндоплазматической сети других клеток в
условиях патологии. Реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в
состав мембранных липидов, радикалы инициируют цепную реакцию их перекисного
окисления. Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) тормозятся
антиоксидантными системами клетки, благодаря наличию которых скорость реакции
образования гидроксильных радикалов и разветвления цепи окисления липидов
находится в пределах физиологической нормы. Постоянное образование
прооксидантов уравновешено той же скоростью их дезактивации антиоксидантами.
Резкое усиление окислительных процессов при недостаточности системы
антиоксидантной защиты приводит к развитию "оксидантного стресса",
который рассматривается как один из общих механизмов повреждения тканей
организма. Реакции окислительного стресса являются результатом нарушения
взаимоотношений между оксидантной и антиоксидантной составляющими
свободнорадикальных процессов за счет гиперактивности или недостаточности
одного из указанных компонентов. В ходе реализации окислительного стресса,
являющегося реакцией организменного уровня, создаются условия для развития
специфических для нервной системы патологических процессов, что в свою очередь
усугубляет окислительный стресс в центральной нервной системе (151).

В связи с вышеизложенным БАД к пище следует изучать как по
изменению активности ферментных систем генерирования свободных радикалов
кислорода и гидроперекисей, так и по изменению содержания антиоксидантных
белков и ферментов, обеспечивающих утилизацию активных форм кислорода, H2O2 и
липопероксидов.

 

Методы оценки действия БАД к пище

на показатели перекисного окисления липидов

 

Мышам - самцам линии Balb/с вводят 0,25 мл 7%-ного масляного
раствора CCl4 - одного из сильнейших стимуляторов ПОЛ, внутримышечно или
алиментарно, через 15 - 20 мин. животным "per os" вводят исследуемую
БАД к пище (5 животных в группе), 5-ти мышам контрольной группы вводят
аналогичный объем физиологического раствора. Через 2 сут. животных забивают,
выделяют печень и определяют продукты перекисного окисления липидов, такие как
диеновые конъюгаты (появляются на начальных этапах перекисного окисления),
гидроперекиси липидов (обнаруживаются на более поздних этапах перекисного
окисления) и малоновый диальдегид (один из наиболее важных конечных продуктов
перекисного окисления липидов).

а. Определение малонового диальдегида в гомогенате печени мыши.

    Печень мыши  растирают в
гомогенезаторе Поттера в 3 мл 0,025 М

трис-HCl (pH 7,4),  содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат
по

2,5   мл  
помещают  в  центрифужные  пробирки  и  осаждают 
белок

добавлением 1 мл 17%-ного
раствора ТХУ (конечная концентрация 5%).

Образующийся  осадок отделяют центрифугированием в течение
10 мин.

при 4000 g.  Надосадочную жидкость переносят в пробирки,
добавляют

по  1  мл  0,8%-ного 
водного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и

помещают пробы на 10
мин.  в 
кипящую  водяную  баню. 
В  качестве

контроля используют пробы,
содержащие вместо надосадочной жидкости

буфер (pH 7,4).  После развития розовой окраски пробы
охлаждают до

комнатной  температуры и измеряют оптическую плотность
при 532 нм.

Количество малонового
диальдегида рассчитывают, используя молярный

                                   5    -1      -1

коэффициент  экстикции 
1,56  x  10   см    x 
М  ,  а  полученный

результат выражают в н-молях
на пробу (152).

б. Определение диеновой конъюгации полиненасыщенных высших жирных
кислот в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера с 9 мл
экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в объемном отношении 1:1.
Полученную суспензию центрифугируют 10 мин. при 4000 g. Надосадочную фракцию
переносят в пробирки и добавляют одну десятую часть объема дистиллированной
воды. После 2-кратного встряхивания и расслаивания фаз отсасывают гитпановую
фазу. К равным объемам по 0,5 мл добавляют этиловый спирт в отношении 1:5 -
1:10. Оптическую плотность проб измеряют при 233 нм. В качестве контроля
используют только экстрагирующую смесь.

    Содержание диеновых  
конъюгатов   рассчитывают,   исходя  
из

величины   молярного  
коэффициента  экстинкции  при 
233  нм  для

                                         5   -1   
-1

сопряженных диенов ПНЖК,
равного 2,2 x 10  см   x М  
(152).

в. Определение гидроперекиси липидов в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера в 3 мл 0,025 М
трис HCl буфера (pH 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по 2,0 мл
помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 0,2 мл 50%-ного
раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок отделяют
центрифугированием в течение 10 мин. при 4000 g. 2 мл надосадочной жидкости
доводят 96%-ным этанолом до 27 мл. К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2 мл
концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора соли Мора в
3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно встряхивают. Точно через 30 с
приливают 1 мл 20%-ного раствора тиоцианата аммония, после чего развивается
малиновая окраска. В качестве контроля используют пробы, содержащие 96%-ный
этанол вместо НЖ. Изменение оптической плотности проводят в течение 10 мин.
после добавления тиоцианата аммония при 480 нм. Об относительном уровне
гидроперекисей в биологическом материале судят по величине оптической плотности
при 480 нм (152).

 

12.3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СХЕМА

МОДЕЛИ НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ОЦЕНКИ

ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

ПАРАФАРМАЦЕВТИКОВ

 




Вид животных


Количество
групп  
животных


Количество
животных
в группе


Продолжительность
опыта      


Название 
групп  




крысы, мыши,
кролики и  
др.        


3    


8 - 10 


в зависимости от
срока получения 
модели          


контроль  
опыт-1    
опыт-2    




 

Описание экспериментальных групп:

контроль - животные находятся на общевиварном рационе или на
обычном полусинтетическом рационе;

опыт-1 - крысы вместе с рационом получают изучаемую БАД к пище на
протяжении одного месяца;

опыт-2 - крысы на протяжении первого месяца находятся на
общевиварном или обычном полусинтетическом рационе.

Через месяц от начала опыта у крыс групп опыт-1 и опыт-2 получают
модель патологического состояния или помещают их в экстремальные условия.

Далее, используя соответствующие тесты, оценивают
профилактические свойства изучаемой БАД.

Конкретные модели патологических и экстремальных состояний
изложены в Приложениях к разделу "Парафармацевтики".

 

13. О ПОРЯДКЕ ПРОВЕДЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ

 

1. При направлении Федеральным центром госсанэпиднадзора в
экспертный совет Института питания РАМН материалов для проведения гигиенической
экспертизы и выдачи заключения с целью последующей государственной регистрации
какого-либо типа БАД вопрос о необходимости проведения клинических испытаний
этой БАД решается главным экспертом экспертного совета.

2. Клинические испытания биологически активных добавок к пище
осуществляются, как правило, в контролируемых условиях стационара или в
амбулаторных условиях в специализированных учреждениях, которые располагают
квалифицированными специалистами в области науки о питании или в
соответствующей области медицины, современным научным оборудованием, хорошей
многопрофильной клинической базой и аккредитованных на проведение подобных
исследований в порядке, установленном МЗ РФ.

3. Образцы биологически активных добавок к пище предоставляются
фирмой в том количестве, которое предусматривается программой испытания.

4. Схема проведения испытаний биологически активных добавок к
пище включает следующие этапы:

- экспериментальную и/или аналитическую оценку основных
компонентов БАД к пище на основании представленной фирмой - производителем
документации и результатов исследований (см. разделы 4, 5, 6);

- разработку программ клинических испытаний биологически активных
добавок к пище, которая определяется, с одной стороны, особенностями
химического состава и предполагаемого биологического действия исследуемых БАД
на организм, применительно к тем нозологическим формам заболевания, при которых
использование добавок с профилактической целью представляется наиболее
адекватным и перспективным, а с другой стороны, типом функциональных и
метаболических нарушений, свойственных данной патологии;

- определение методики проведения клинических испытаний. Для
получения достоверных данных о профилактическом действии БАД к пище необходимым
условием является наличие двух групп: основной (опытной) и контрольной. Они
могут формироваться из здоровых лиц или больных с определенной патологией.
Группы сравнения должны быть максимально сходными по половозрастному признаку,
массе тела, пищевому статусу. В случае проведения испытаний на больных помимо
этого учитывается степень тяжести основного заболевания, характер сопутствующей
патологии. Оценка эффективности БАД к пище осуществляется на фоне идентичных
режимов питания в опытной и контрольной группах. Предпочтительным при этом
является использование двойного слепого метода испытаний с применением плацебо
в контрольной группе. В процессе проведения клинических испытаний определяются
органолептические свойства БАД и их переносимость, осуществляется оценка их
эффективности, выявление возможных побочных эффектов;

- помимо общих клинических показателей в план исследований
включаются гематологические и специальные функциональные тесты, биохимические,
микробиологические, иммунологические и другие показатели. Выбор критериев
оценки эффективности апробируемых БАД к пище определяется характером испытуемых
БАД и клинико - патогенетическими особенностями нозологических форм, при
которых они применяются;

- продолжительность клинической апробации устанавливается в
зависимости от типа БАД к пище и по согласованию с фирмой - заявителем;

- в заключении по итогам испытания БАД должны быть представлены
результаты изучения переносимости БАД, ее эффективности, рекомендуемая
дозировка БАД, показания к применению, возможные побочные эффекты.

 

Клиническая оценка эффективности БАД

к пище и их переносимости

 

1. Оценка органолептических свойств БАД и их переносимости

Изучение органолептических свойств БАД осуществляется с
использованием анкетно - опросного метода. Оценивается вкус, запах, цвет,
консистенция БАД, наличие посторонних запахов и т.д.

Переносимость БАД оценивается путем клинического наблюдения по
субъективным и объективным признакам. Исследуется:

состояние кожных покровов;

системы пищеварения;

сердечно - сосудистой системы и других органов и систем
организма.

2. Оценка БАД